北京大学取得疫苗研发领域“革命性突破”，利用活体禽流感病毒制作疫苗

源济

北京大学取得疫苗研发领域“革命性突破”，利用活体禽流感病毒制作疫苗

麻省理工科技... 12-03 09:11   4070 大

北京大学的研究者开发出一种新型疫苗研发技术，通过在天然病毒株遗传序列中引入过早终止密码子，使得改造后的病毒在普通细胞中丧失复制增殖能力，但却保留完全的感染活性。研究者利用这种完全活性的病毒制作疫苗，能够有效诱发强大的体液、粘膜以及免疫T细胞介导免疫反应应对抗原性病毒，甚至能中和已受感染者体内存在的病毒株。这种疫苗技术有望成为一种应对几乎所有病毒的普适性方法，特别是全球众多致命性病毒。

该研究结果发表于12月2日《Science》上，并被称为疫苗研发领域的“革命性突破”。

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这项研究打破了传统疫苗研发的两项禁忌：一项是利用活体的、完全感染性的病毒作为疫苗，第二项是将该疫苗注射进感染同种病毒的将死动物体内。根据论文结果，接受该疫苗的受感染动物最终都治愈了。

这项突破能够大幅简化疫苗生产流程、提高研发效率，有望使科学家在病毒爆发数周内迅速研发出针对多种病毒（如禽流感、埃博拉、艾滋病等病毒）的有效疫苗、甚至能够彻底治愈。

研究者在疫苗活体病毒的遗传密码中引入过早终止密码子（PTC），从而使得该病毒的自我扩增机制失效，同时完全保留其感染性以激活宿主动物细胞的免疫反应。

同时，研究者利用遗传密码扩增（Expanded genetic code）技术，使得在普通细胞中不能增殖的病毒疫苗能够在一种转基因细胞系中实现增殖和批量化生产。

通常，医用保留完全感染性的活体病毒作为疫苗是传统疫苗研发的一大禁忌，因为病毒的增殖速度十分惊人。当前市场上广泛售卖和使用的疫苗都是灭活或者较弱感染性的病毒。

通常，批准临床使用的疫苗都会通过改造病毒结构降低其感染性，但同时也降低疫苗的有效性。此外，目前对于全球多种致命性病毒甚至还未研发出任何有效的疫苗。

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项目负责人——北京大学药学院教授周德敏

周德民教授在《南华早报》的采访中表示：“长久以来，在对抗病毒的战争中人类一直处于下风。现在，我们终于有了新的武器，几乎可以应对所有的病毒及其突变体，这将逆转战争的局势。”

周德民团队利用活体禽流感病毒制作疫苗，并进行了包括小鼠、荷兰猪和白鼬在内的疫苗注射动物实验。虽然病毒入侵宿主后对宿主细胞产生了严重损伤，但这些活性病毒自身并未发生复制增殖。随后，宿主免疫系统启动，逐个清除细胞内的病毒。仅在注射疫苗三天后，宿主体内的病毒已被完全清除，同时获得了对抗该病毒的免疫能力。

然后，研究者又向感染禽流感病毒的小鼠注射疫苗，最终小鼠迅速获得康复。

研究表明：在宿主体内，这种人工改造的活性病毒与野生型病毒发生遗传重组，所以重组后的病毒也丧失自身复制能力。

周德民表示：“这不仅是疫苗，也是一种药物。”

该研究所用改造型活性禽流感病毒与其天然型病毒株有99%的相似性。研究只是随机选取了编码病毒核蛋白的遗传序列上的一个密码子*，并通过定点突变将其替换为终止密码子，最终制造出同时保留感染活性而丧失增殖能力的“过早终止密码子”（PTC）病毒株。

*密码子（codon）是指信使RNA上的一个核苷酸三联体序列，在蛋白质翻译合成时代表某一种氨基酸。终止密码子（terminationcodon）是代表翻译终止的核苷酸三联体序列。

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人工改造后丧失增值能力的活性病毒。左路：该病毒感染普通细胞无法实现自我增殖；右路：该病毒感染特殊转基因细胞，实现自我扩增和批量化疫苗生产。

通常，病毒需要宿主体内多种氨基酸来合成其蛋白质外壳，而改造后的病毒只能利用一种特殊的人工合成氨基酸合成外壳进行复制。宿主体内缺乏特殊的氨基酸，所以病毒无法复制增殖，最终只能“饿死”。

研究者基于一种人工转基因细胞系进行疫苗病毒的扩增和批量生产，这种转基因细胞系含有这种特殊的氨基酸作为病毒扩增原料。

据周教授称，这种疫苗技术前景很好，可能很快就会投入使用。比如，一旦有了像非典病毒这种大爆发时，这种疫苗技术可以帮助国家快速响应并控制病情。

对于任何病毒爆发，研究者可以快速从感染者体内分离得到这种未知病毒株，并只需选取病毒遗传序列的一个密码子并改造为终止密码子病毒株，新病毒就可以作为疫苗推广接种。

所有这一系列的研发过程可以在短短几周内完成，达到快速响应、及时控制病情。这种疫苗同样也可以用于治疗已经感染病毒的病人。

周教授表示，“这种方法的副作用很小，受试者几乎感觉不到任何副作用。我认为，这种技术很快就会造福人类。”

研究团队已经为此技术申请了专利，同时他们正在联系疫苗厂家以尽快开展临床试验。

传统的疫苗研发流程复杂而漫长，研究者需要弄清病毒的结构和行为之后，才能对症下药。但是这种新方法大大简化了疫苗研发的流程，我们只需要改造病毒遗传序列的几个碱基就可以生产疫苗。同时，因为这些编码密码子的三联碱基序列存在于几乎所有的病毒内，所以这种方法有很强的普适性。

中科院病原微生物与免疫国家重点实验室研究人员孟颂东表示，周教授团队的研究是一种“全新的、前所未有的方法”，为我们对抗病毒指明了新路。

然而，他同时也表示了对这项研究近期用于临床的担忧。这种人工改造的病毒有可能发生意外的突变，打破原本对其自我复制性的限制，这将带来不可估量的后果。此外，人造病毒和天然病毒重组后的结果可能并不像我们预期那样好。

孟松东表示：“这项研究的风险在于改造后的病毒可能变得毒性更强，甚至复制更快。我认为，没有任何国家的卫生部门，尤其是中国，会批准在病人体内接种活性病毒疫苗。”

参考：http://science.sciencemag.org/co ... 04363et_cid=1031518

源济

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 Vigorous Cooler，轴，乱，顽。可惜俗务缠身。

这真是个巨大的突破，突破了原有减毒活疫苗的设计框架，等于是直接开创了新的疫苗制备体系，前景不可限量。

Generation of influenza A viruses as live but replication-incompetent virus vaccines

【0】首先简单介绍一下背景：（甲型）流感病毒（influenza A virus）是分节段的单负链 RNA 病毒，总共 8 个片段，负链的意思是与 mRNA 的顺序刚好 5'到 3'反向互补，IAV 也是反向遗传学体系非常成熟的模式病毒之一。IAV 的 8 个片段编码的基因分别是血凝素 HA、神经氨酸酶 NA、基质蛋白 M、核蛋白 NP、非结构蛋白 NS，还有 PA、PB1 和 PB2 三个蛋白组合起作为病毒的 RNA 依赖的 RNA 聚合酶（RdRp）；

对于反向遗传学操作，现在一般是8 质粒系统，也就是子小答案里说的，8 个基因片段构建的双向载体，可以同时翻译蛋白和转录出负链基因组，所以，转染 8 质粒就可以获得流感病毒了，这一点是文章里对病毒进行突变的基础。

还有几个专有名词可能对理解有帮助——

CPE：致细胞病变效应，一般用来评价病毒的增殖情况，通常的特征有细胞变圆，肿胀，脱落，或者融合形成多核巨细胞等等。

质粒：如果这个不清楚，那.......

LD50：半数致死量，比方说病毒 100 倍稀释的时候，每只动物接种 1ml 会死一半，这个滴度就是病毒的 LD50；

PFU：空斑形成单位，病毒感染性颗粒的计量单位；

血凝抑制： hemagglutination inhibition (HAI) ，流感病毒的 HA 蛋白叫做血凝素，可以凝集鹅血球，而如果人的血清中有针对 HA 的抗体的话就可以抑制 HA 诱导的血凝现象，这种现象叫做血凝抑制；具有该作用的抗体叫做血凝抑制抗体。

中和：neutralization (NT)，中和抗体，顾名思义，也就是血清中具有中和病毒的抗体，被中和的病毒就失去了感染性。

详细细节可以参考：

知乎专栏- 巴尔的摩分类体系；

只有病毒 DNA 或 RNA 的情况下是否能复制完整的病毒出来？

【图片来自 viralzone】

【1】作者首先是构建了一株细胞系，把正交翻译系统（orthogonal translation system），导入到人胚肾 293T 细胞中，使用的正交系统用的是 正常情况下 20 个氨基酸以外[orthogonal unnatural amino acid (UAA)]的 Nε-2-azidoethyloxycarbonyl-L-lysine，配对的系统是 Methanosarcina barkeri MS pyrrolysyl tRNA synthetase（tRNA 合成酶）/ tRNACUA，同时这个细胞里面有一个绿色荧光蛋白（GFP），但是在位置有一个被修饰的位点，在普通细胞中 39 位就是 TAG 终止了，但是在这个细胞系里，也就是不添加UAA（Nε-2-azidoethyloxycarbonyl-L-lysine）的时候，GFP 是不表达的【下图 B】，但是添加 UAA 之后，这个终止密码子就可以翻译了，也就是加入 UAA 细胞就变绿了。而且这个细胞系构建出来后比较稳定，增殖 200 代这些表型也没问题。而且，用这个细胞转染 8 质粒系统产生的流感病毒与正常的细胞产生的流感病毒在滴度上没有差别【下图 C】；

下边开始就是重头戏了，利用这个正交系统的 293T 细胞，作者在流感病毒 NP 上随机选了一个位点（Asp101），进行了突变，也就是说在普通细胞中转染 8 质粒系统的时候 NP 是不完整的，不能翻译出 NP，所以这个突变后的 NP 质粒，只有在正交系统 293T 细胞中才能产生流感病毒。作者称为PTC virus（premature termination codon），在这个细胞中添加 UAA，病毒是可以包装出来的【下图 D】，而且也只能在这个细胞添加 UAA 的情况下才能出现CPE【下图 E】。

所以作者构利用 8 质粒系统，在 NP 上添加终止码之后，只能在正交系统 293T 细胞添加 UAA 的情况下包装出来病毒，而且这个病毒的 NP 基因组也是有终止码突变的，也就是说在正常细胞中并不能复制【下图 A】。

Fig. 1

Establishment of a virion packaging system that is compatible with the orthogonal translation machinery.

【2】我们知道流感和艾滋的疫苗为什么难弄，就是因为基因组的突变快，导致抗原变异，那么会不会这种终止码突变的毒株也会突变回来呢？

作者为了验证这个问题，就在 NP 随机突变了好多个三连码位点【下图 A】，然后发现这些突变的病毒增殖的动力其实区别不大【下图 B】，而且都不能在正常细胞上复制【下图 C】。除了 NP 之外，流感不是 8 质粒吗，作者又在除了 HA 和 NA 之外的质粒上进行了突变（这两个是主要的中和抗体靶标），结果也都差不多，只在 HA-Lys57, NS-Phe103, PB2-Gln13, PB2-Thr35, M2-Lys49, and M2-L 等位点上回复突变率要高几个数量级，并最终逃脱了 UAA 依赖。

所以，既然有回复突变的可能，那么是不是在设计的时候就多用几个同时突变的终止位点不就能大大降低回复概率吗？——单点突变的回复突变率是 1.0 × 10−8 (PTC-1), 双点突变是 1.2 × 10−10 (PTC-2), 三点突变就基本上检测不到了 (<10−11)【下图 C】。

再进一步，作者想看看在（动物）体内的回复突变的可能，作者选了一个毒株（PIC-4A）作为代表【下图 4D+E】，在小鼠、豚鼠和雪貂上进行实验（常用的流感动物模型）；

Fig. 2

Genome-wide investigation and characterization of the PTC influenza viruses.

【3】在小鼠模型中，WSN 毒株通常在半数致死量是 8 × 10E3 PFU，而用 10 倍 LD50 的时候（也就是 8 × 10E4 ），小鼠会全部死亡【下图 A 左】，而且体重会显著降低。但是 PTC-4 对照组中，这种病毒即使用到了 10E9 PFU，也就是比正常 LD50 高 10E5，都不会有小鼠死亡，体重也不会减轻【下图 A 右】。攻毒三天后小鼠各脏器的病毒载量，PTC-4、减毒活疫苗（温度敏感株）和野毒株在鼻 turbinate, 气管 trachea 和肺脏 lung 里的病毒载量分别是 10E1.6, 10E1.5, and 10E1.3 PFU/g 、10E3.5, 10E2.9, and 10E1.8 和 10E5.5, 10E5.7, and 10E6.5【下图 B】。

前面也说了，PTC-4 这种密码子突变的病毒在正常细胞上是不会复制的，所以在正常细胞中也不会产生空斑【下图 C】，在正交细胞添加 UAA 的情况下才有空斑形成。

而且，在同笼培养的豚鼠中，接种过 PTC-4 的豚鼠并不会把病毒传染给其他未接种的豚鼠，而在野生型和减毒疫苗组中，这是普遍现象（流感毕竟是空气传播的）；

所以说，三种动物的实验都证实了突变病毒是非常安全的。

Fig. 3

Characterization of the in vivo safety of the PTC viruses.

【4】既然突变病毒很安全，也基本不会回复突变，那么作为疫苗来说免疫效果咋样呢？

作者比较了 PTC-4A 和灭活疫苗IIV（inactivated influenza vaccine）以及减毒疫苗 CAIV。

10E6 PFU 免疫小鼠，10E7 PFU 免疫雪貂和豚鼠。三周后，全病毒疫苗—— PTC-4A 和 CAIV 免疫后的血清都具有强烈的血凝抑制 /HAI和中和 /NT效应；而灭活疫苗即使在免疫两次后效果也不明显【下图 A 左 1+2】。

而 PTC-4A 在此免疫后，可以诱导血凝抑制抗体和中和抗体水平上升 6~8 个级别（如果是 2 倍倍比稀释的话，倍数也就是 64~256 倍）【下图 B】。而且黏膜免疫的主要抗体 IgA 只在 PTC-4A 和 CAIV 上被诱导出来，而灭活疫苗没有（很好理解，因为只有活病毒才有类似正常感染的效果）【下图 A 右 2】。

好，因为抗体都是体液免疫应答，对于病毒感染来说，细胞免疫应答也很重要，这部分主要是杀伤性的 T 细胞（cytotoxic T lymphocytes/CTL），PTV-4A 和 CAIV 诱导的 CTL 是灭活疫苗的 10 倍以上，灭活疫苗只在肺部具有正基线水平的 CTL【下图 A 右】。

好，那既然纸面上的免疫效果这么好（抗体和 CTL，做疫苗最常用的指标），但是，既然作为疫苗，最主要的还是要看保护效果，所以，最后一点是看 PTV-4A 的保护效果，还是跟灭活苗和减毒苗相比较。每组 15 只，免疫 3 周后，动物经鼻腔攻毒 50 倍 LD50 的野生型病毒，攻毒 3 天后，每组处死 5 只，用于滴定肺部的病毒载量；在减毒苗和 PTV-4A 的免疫组，尤其是两次免疫组，病毒滴度下降了 1000 倍，体重也没啥变化，而且所有 PTV-4 和 CAIV 组的剩余动物全部存活【下图 D】；

Fig. 4

Characterization of the immunogenicity and protective efficacy of the PTC-4A virus in BALB/c mice that were intranasally inoculated with one or two doses.

【5】作者又测试了，这一种突变病毒是不是对其他抗原类别不一样的流感病毒也有保护作用（大家应该也清楚什么 H9N1，H5N6，H5N1，H1N1 等等，这些都是不同的抗原型别），15 只小鼠，单次免疫 PTV-4A，再用 10E6 PFU 的重组 H1N1 或者 H3N2（ influenza A/reassortant/NYMC X-179A (pH1N1) or A/Aichi/2/68 (H3N2) viruses）来攻毒，结果发现保护效果也很好，病毒滴度降的也多，这可能是共同的保护抗原和病毒特意的 CTL 起到的保护作用。

其实到这一步文章已经非常完美了，但是这篇文章居然还有一个更为亮点的信息。

因为对于其他正常的减毒活疫苗来说，跟野生病毒混合，会恢复原来的毒性。但是作者发现，把 PTV-4A 跟野生型病毒去混合，反而大大降低了原来病毒的滴度，这应该就是不同的基因组会重组，但是野生型的重组了 PTV-4A 的突变基因组反而把自己的复制能力给丧失了。这就有意思了，也就是说这种疫苗还具有治疗性的作用！

【5】总结

Our results show that we succeeded in generating live but replication-incompetent virus vaccines by applying genetic code expansion to the influenza virus genome. Such live vaccines elicited robust immunity against both parental and antigenically distinct strains. Generation of such PTC virus vaccines can be potentially adapted to almost any virus (27) so long as their genome could be manipulated and packaged in a cell line. Furthermore, the multiple PTC-harboring viruses are not only prophylactic but also therapeutic vaccines in the neutralization of the replicating viruses.

原文的总结贴出来了，其实就是两条，非常 impressive。

第一——只要是能反向遗传操作的病毒，都能这样用特殊细胞系来制备疫苗，太帅了。

第二——疫苗不光能发挥预防作用，还能发挥治疗作用，更帅了。