万“绿”丛中，科学家苦苦寻觅的“一点红” |《自然》技术特写

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万“绿”丛中，科学家苦苦寻觅的“一点红” |《自然》技术特写

Original Nature Portfolio Nature Portfolio  2022-02-10 12:40

原文作者：Amber Dance

生物工程学家把荧光蛋白变得越来越“红”，从而不断丰富生物成像的调色盘、提高穿透深度。

作为一项曾获诺贝尔奖的技术，绿色荧光蛋白（GFP，green fluorescent protein）在显微学研究中有广泛应用，在许多生物领域、实验室和各种技术中出色地“点亮”目标分子。然而这项技术并不适用于物理化学家Julie Biteen的实验。

Biteen在美国密歇根大学研究肠道菌群，她曾渴望使用荧光蛋白从复杂的混合物中识别单个微生物物种。但肠道细菌具有厌氧特性，而氧气对于绿色荧光蛋白不可或缺。没有氧就没有荧光。

Biteen转向一种能在无氧条件下工作的标记——IFP2.0，一种位于近红外区域的新型荧光蛋白。电磁光谱中的这部分区域无法通过人眼观测，但在显微摄像机下非常明显[1]。她说：“我们能看到单个细胞并识别出来，这真的太让人激动了。”

插图：The Project Twins

于光谱红色端成像还有别的优势：背景荧光更低，毒性更弱，还能穿透更深的组织。蛋白质工程学家Robert Campbell（他的职业生涯一半在东京大学，一半在加拿大阿尔伯塔大学）说：“在其余条件不变时，越红越好。”而且它还让研究人员在实验中能多一两种颜色。哈佛医学院的显微镜学家Talley Lambert说：“在不造成明显荧光窜色时，实验中能够添加的通道越多，我们就能研究越多的相互作用。”

带点红色的荧光蛋白面世已有数十年，但它们在亮度和色彩上普遍无法企及GFP的效果，被称作“红色”的荧光蛋白（red fluorescent protein，RFP）事实上更接近橙色。科研人员在研发具有纯正红色的荧光蛋白中已取得了进展，区别于早先产品，这些蛋白也被称为“远红（far red）”。红外区域也有类似的优势。相关研发工作还处于起步阶段，但生物勘探、蛋白质工程、合成化学等方面的技术进步正在帮助改进这些标记。其中大部分能以基因形式从质粒信息库Addgene中获取。

需求明显存在。研究人员迫切需要能与标准工具（绿或蓝光激活的GFP、蓝色DNA染剂和光敏感通道蛋白）并行使用的标签和探针。赛默飞世尔（Thermo Fisher）的高级产品管理经理Brian Almond说，“换一个颜色”经常是客户对新荧光工具的首要需求。“啥都是绿的”，他们说，“拜托了，别再做绿的。”

鲜红之道

通常的荧光显微实验，可以用三种光色而不致重叠。但挑选能够同时工作的标记不仅仅是简单的黄-绿-蓝。有数百个荧光蛋白可供选择，颜色、亮度、荧光寿命各有不同。有些是蛋白质单体，另一些则可能相互粘连，甚至将目标蛋白与相似蛋白粘连，对结果造成干扰。因此，尚不存在能够胜任各种应用的“万能”荧光蛋白。

渥太华大学的蛋白质工程学家Roberto Chica提醒说，选择标签时最好避免过度依赖已出版数据。试管中表现良好的蛋白质有可能在模型生物内并不发光，而且数据列表通常不完整。最好是在测试数个荧光蛋白后，择优进行实验。

有一些免费网络资源能帮助研究人员挑出候选的荧光蛋白，例如Lambert所创的FPbase、赛默飞世尔的Fluorescence SpectraViewer、以及由美国BioLegend公司开发的Fluorescence Spectra Analyzer。用户可浏览数百个荧光蛋白和染料的激发与发射光谱，通过输入光源、滤光器和检测器，做出相应的选择。

使用多种色光的策略之一，是在数据收集完成后由电脑找出重叠的发射光谱，称作“光谱成像与线性分离（spectral imaging and linear unmixing）”或“荧光分离（fluorescent unmixing）”。研究人员能够检视更多色光——同一流式细胞术实验可使用多达40种标签，BioLegend产品经理Kenta Yamamoto说。但他提醒说这要求周密的规划：例如，比较稀少的蛋白质可能需要与更明亮的标记组合，才能使其凸显出来。

一个简单点的方法是使用一种不会与任何其他颜色重叠的颜色，这正是近红外和远红标记的用武之地，它们很容易就能在同一细胞中产生至少四条非重叠信号。中国西湖大学的工具研发人员Kiryl Piatkevich常规使用三种可见光和两种近红外光，可以记录同一显微镜载玻片中的五条信号。类似实验通常无需重大设备升级即可完成。

荧光团从何处来

许多荧光蛋白发现于海洋生物，但远红和近红外分子更多来自细菌。与GFP及其类似蛋白质不同，细菌的光受体自身缺少一种吸收光源的组分：生色团（chromophore），它们需要添加一种名为胆绿素（biliverdin）的色素。好消息是胆绿素是血红素（haem）分解的中间产物，血红素在血液中结合、运输氧气，因此它在哺乳动物中天然存在。坏消息是胆绿素由于分解速度过快，含量不够丰富。

解决方案一是增加胆绿素，可从化学供应商处获取，或改造生物使之合成更多的胆绿素。另一个方案则是通过蛋白质工程改进远红蛋白和近红外蛋白在非天然环境中的表现，例如增强蛋白质与色素间结合，Valdislav Verkhusha说。他是纽约市阿尔伯特·爱因斯坦医学院的分子生物工程师。他的团队在体外条件下将相关基因进行随机突变，经大肠杆菌（E. coli）表达筛选出最红或最亮的产物。在一项研究中[2]，通过十七轮分子进化，获得名为miRFP670nano的近红外蛋白质标签。其大小约为GFP的60%，能够有效地结合胆绿素并在哺乳动物细胞中产生明亮荧光。

Piatkevich也运用分子进化的方法，但使用了哺乳动物细胞，这会折叠蛋白质，使其相较在微生物中演化而言更能紧密匹配目标细胞。这个团队运用该方法增强近红外荧光电压传感器（用于监控神经细胞放电）亮度，创造出一种称为Archon1[3]的传感器。

直接用蛋白质工程也是可能的。哈佛医学院合成生物学家Timothy Wannier在加州理工学院攻读博士学位期间，对GFP家族同时使用分子进化和基于计算机的蛋白质分析和分子设计。他致力将远红荧光蛋白二聚体转为蛋白单体以避免不良相互作用，但同时还需设计突变以稳定单体[4]。

在产出的结果中，有一个名为mKelly1的标记吸引了阿尔伯塔大学的蛋白质工程学家沈溢的注意，进而研发出名为FR-GECOs的远红钙离子传感器[5]。

没有最红，只有更红

虽然已经有了不少进展，但远红和近红外荧光蛋白的亮度依然黯淡。有些绿色荧光蛋白不断刷新着亮度极限，而最好的近红外标记仅能达到最大亮度的10-20%。

一个办法是基于近红外和远红化学染料的变通方案，这些产品的也正在变得越来越易得。美国霍华德·休斯医学研究所的有机化学家Luke Lavis研发出一种明亮、无毒的染料，能够响应环境在无色与荧光间切换[6]。Lavis与蛋白工程师同事Eric Schreiter合作，将染料与蛋白质配对，形成“化学遗传的（chemigenetic）”细胞传感器。

通过基因编码的“HaloTag”作为合成染料底座，与传感蛋白相连，在存在钙离子或电压时发生形变[7]。形变导致局部环境的变化，使得染料发出荧光。据Schreiter介绍，其亮度十倍于此前研发的红色传感器。Lavis将他的染料无偿提供给其他科学家。如今Lavis正在测试新一代染料，他期望它们能够穿透更深的组织以应用于活体研究。

“这类传感器前途‘光明’。”Schreiter说。他补充道，当下任意传感器中的GFP，应该都能用HaloTag制造的全新红色“化学遗传”传感器来替代。但对彩虹谱剩下的部分，Lavis认为使用标准荧光蛋白应该绰绰有余，“因为它们棒极了。”

参考文献：

1. Yu, D. et al. Nature Commun. 5, 3626 (2014).

2. Oliinyk, O. S., Shemetov, A. A., Pletnev, S., Shcherbakova, D. M. & Verkhusha, V. V. Nature Commun. 10, 279 (2019).

3. Piatkevich, K. D. et al. Nature Chem. Biol. 14, 352–360 (2018).

4. Wannier, T. M. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 115, E11294–E11301 (2018).

5. Dalangin, R. et al. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.11.12.380089 (2020).

6. Grimm, J. B. et al. Nature Meth. 17, 815–821 (2020).

7.Deo, C. et al. Nature Chem. Biol. 17, 718–723 (2021).

原文以The hunt for red fluorescent proteins为标题发表在2021年8月5日《自然》的技术特写版块上