改进糖类研究的工具箱 |《自然》技术特写

源济

改进糖类研究的工具箱 |《自然》技术特写

Original Nature Portfolio Nature Portfolio  2021-12-22 12:40

原文作者：Amber Dance

为聚糖领域研发的抗体和其他试剂进展不及蛋白质和核酸领域，不过研究者正奋起直追。

糖在生物学中无处不在。它们可以修饰细胞、蛋白质和脂质。今年6月发表的一项惊人发现显示，它们甚至参与对RNA的修饰[1]。然而这些碳水化合物（又名“聚糖”），近几十年来所受关注甚少。

“聚糖构成了一种重要的生物学语言，即糖组（glycome）”，澳大利亚格里菲斯大学糖组学研究所的所长Mark von Itzstein说道。它们参与细胞间通讯和免疫反应、在癌细胞中出现改变，也可被病原体用来实现在宿主细胞中的定植。仅根据人类红细胞表面聚糖上所存在的少许差异，便可将人类血液划分为A、B、AB或O型等不同血型。此外，当SARS-CoV-2的冠状病毒试图入侵细胞时，正是聚糖使SARS-CoV-2免遭免疫系统清除，并形成刺突蛋白[2]。“刺突需要聚糖屏障才能‘开门’”，Elisa Fadda说，她是爱尔兰梅努斯大学的计算糖类科学家，也是做出该研究的团队一员。

插图：project twins

然而，大多数生物学家的注意力都放在了DNA、RNA和蛋白质上。其中部分原因在于，与那些有着规律编码的生物分子相比，聚糖分子极为复杂。区区数种单糖在通过多种方式连接起来之后，便会产生各种各样的分支结构，而其最终的结构形式，将取决于数十种添加或移除糖基的酶中哪些参与了其合成过程。“其高度复杂性实在令人头昏脑胀”，加州大学圣地亚哥分校 （UCSD）的内科医生兼糖类生物学家Ajit Varki说。

此外，能用于聚糖研究的工具现在也很少，美国国立卫生研究院（NIH）糖科学项目的联合负责人Douglas Sheeley说。该研究项目旨在建立相应的工具集，例如资助了对GenBank等生物分子数据库的自有解决方法（网址为GlyGen.org）。研究人员可以在网站上检索自己所感兴趣的蛋白质，从而了解哪些聚糖是目标蛋白质的已知聚糖修饰，也可从特定的聚糖结构出发来探寻携带该聚糖结构的蛋白质。

在实验室研究中，糖类生物学家希望能够像在蛋白质研究中使用抗体那样，针对糖类分子开展功能测定、免疫印迹、细胞染色以及其他实验。但尽管已有数种能与聚糖相结合的“亲和试剂（affinity reagent）”，其使用效果却大多并不理想。一些科学家正尝试对它们进行改良，而其他一些科学家则正在自然环境中寻找新的选择，例如人类口腔里的微生物群或海洋七鳃鳗的血液。这些新试剂有望使糖类生物学实验变得简单，即使对非专业人士也易于上手。

升级天然分子

历史上用于识别聚糖的主要亲和试剂是凝集素（lectin），一种来源于多种生物的天然性糖类结合蛋白。但美国乔治亚大学的糖类生物学家Lance Wells说该领域的大多数研究人员对凝集素爱恨交织。凝集素的突出优势并非性能有多优异，而是用Lance Wells的话说，主要是因为它们 “已经在那里了” 并容易获取。例如，美国加利福尼亚州的Vector Laboratories就有售卖基于凝集素的、可用于识别不同聚糖片段的筛选试剂盒。

凝集素的缺点是对单种聚糖无法做到特异性识别。它们与聚糖靶标的接触面比较浅，不是锁和钥匙程度的适配，而是更像杯子和碟子。维也纳自然资源与生命科学大学的糖类生物学家Iain Wilson说：“凝集素很适合初筛，就像‘唔，这儿有糖蛋白吗？’”，然而“是否能与凝集素结合，并不能用于证实这个结构”。

von Itzstein说，目前有一种颇具吸引力的方法是对凝集素进行工程化改造，使其更好地适配所需靶标。利用该方法，美国新英格兰生物实验室（NEB）的科学家们找到了一种特殊的凝集素，可与蛋白质中所有连接在天冬酰胺残基上的聚糖（N-聚糖）结合，但不会结合连接在丝氨酸和苏氨酸残基上的聚糖（O-聚糖）。研究人员从 Fbs1（一种在正常生理情况下参与降解畸形糖蛋白的蛋白质）开始，通过随机诱变和筛选，创造出他们想要的试剂[3]。发明人之一、该公司蛋白质表达和修饰研究的科学总监Chris Taron表示，团队乐于分享研究用版本，商业版本应能在 2022 年初面世。后者将成为NEB的“创新之酶”（Enzymes for Innovation）产品系列的一部分，价格通常为70至300美元。

位于美国佐治亚州的 Lectenz Bio ，是另一家利用蛋白质工程将作用于糖类分子的高度特异性酶改造为精制亲和试剂的公司。

挖掘“海中宝藏”

传统抗体也有潜力用作聚糖的亲和试剂，但它们很少能与目标抗原紧密结合，还会与其他靶标分子产生交叉反应。这导致一种观念认为生成抗体对糖类没有用，但哈佛大学医学院糖类科学中心的联合主任、糖类免疫学家 Rick Cummings认为这只是以讹传讹。他说只要找对地方，你会发现很多能靶向各种糖类分子的兼具特异性与高亲和力的抗体。

在2000年前后，美国埃默里大学的免疫学家Max Cooper就找到了这样的“地方”：无颌的海七鳃鳗（Petromyzon marinus），一种圆嘴里长满牙的蛇形生物。Cooper与有颌生物的免疫系统，发现七鳃鳗的抗体结构有与有颌生物有所不同，即月牙形的结合位点[4]，它们比哺乳动物抗体中的结合位点在结构上更稳定，因此更不易弯曲并与预期靶抗原相似的其他抗原结合，从而赋予了其在结合抗原上的高特异性。德国马克斯·普朗克免疫生物学和表观遗传学研究所的进化免疫学家Thomas Boehm说：“它可以区分许多抗体看来差不多的聚糖。”

“你可以造出具有前所未有高特异性的抗体”，Cooper说。该项目的合作者Cummings还曾非常吃惊地对他此前未知的聚糖识别出了七鳃鳗抗体。

Cooper在美国亚特兰大共同创立了一家名为NovAb的公司，以生产用于识别传统抗体无法结合的靶分子的七鳃鳗抗体。联合创始人兼首席执行官Ed Cannon表示，产品之一会是一种 “抗体魔术贴” ，具有针对既定靶分子的多个重复结合域，以确保牢固、不可逆的结合。

与此同时，Cummings通过将复杂的免疫原（如细胞或人乳）接种至七鳃鳗的方式，创造出了多种抗体，并已在酵母文库中将这些抗体编码。他的研究中心可以与其他研究者进行合作，利用微阵列技术研究特定的糖类，发掘文库中是否存在什么东西能与之结合。如不存在，该研究中心还可以免疫七鳃鳗产生新的抗体。

为使七鳃鳗抗体能够更便利地满足实验室应用乃至治疗应用的需求，Cooper和Cummings设计了杂交分子（hybrid molecule），即融合哺乳动物抗体的“基底”部分（其 Y 形结构的垂直部分）与七鳃鳗抗体的结合域部分[5]。那些已经被用于识别传统抗体的二次抗体，可用于检测这些新的“智能抗聚糖试剂”。

试剂近在眼前

人类体内常见聚糖亚单位的分子骨架多由六个碳原子所构成，但另一类名为唾液酸的糖类分子的骨架则由九个碳原子所构成。“如果你觉得聚糖结构复杂得吓人，那唾液酸的复杂程度甚至能吓到糖类生物学家”，Varki说道。唾液酸的种类多达五十几种，通常覆盖于聚糖分子的分支结构上。它们带有负电荷，这使得含有唾液酸的糖蛋白分子之间可以互相顺畅滑动，从而维持如口腔内部等光滑表面；没有这些分子，我们的口腔会一直干燥，纽约州立大学布法罗分校的口腔生物学家Stefan Ruhl说。

Ruhl曾是一名执业牙医，他说那些结构尖端被唾液酸所覆盖的糖蛋白也可以使细菌能够黏附于我们的牙齿，为这些细菌蛀蚀牙齿提供立足点。他推断这些微生物一定已经进化出可与我们体内的唾液酸完美结合的分子，而且他已经在链球菌中发现了一些，希望很快能发表相关研究细节。作为NIH糖类科学项目的一部分，Ruhl的实验室将免费提供基于这些分子研发的试剂。

Varki的团队也利用微生物作为制备唾液酸亲和试剂的来源。该团队推出了一款由9种试剂组合而成的试剂盒，包括细菌来源的凝集素和毒素、病毒来源的结构蛋白和酶、一种植物来源的凝集素、以及一种鸡来源抗体[6]。该试剂盒包含一个用于检测哺乳动物唾液酸的通用检测器，以及针对哺乳动物中常见特定结构或连接的数个检测器。病理学家Nissi Varki说就组织染色来说，该试剂盒比一些需要特殊缓冲液条件的凝集素使用更为简单，她是加州大学圣地亚哥分校表型比较中心的组织病理学/小鼠表型分型部主任。她的丈夫Ajit Varki已在尚未发表的工作中运用这些试剂，研究唾液酸在小鼠结肠炎模型中所起的作用。

由于人类对聚糖所知甚少，还有许多有待学习。“我们就像孩子进了糖果店”，Ajit Varki 说，“坏消息是店里还没几个孩子。”而新试剂的出现，应该能让其他生物学家更容易尝到甜头了。

参考文献：

1. Flynn, R. A. et al. Cell 184, 3109–3124 (2021).

2. Casalino, L. et al. ACS Cent. Sci. 6, 1722–1734 (2020).

3. Chen, M. et al. Nature Commun. 8, 15487 (2017).

4. Cooper, M. D. & Alder, M. N. Cell 124, 815–822 (2006).

5. McKitrick, T. R. et al. Commun. Biol. 3, 91 (2020).

6. Srivastava, S. et al. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2021.05.28.446202 (2021).

原文以Refining the toolkit for sugar analysis为标题发表在2021年11月1日《自然》的技术特写版块上