定制草莓，驯化番茄：基因编辑有前途 |《自然》技术特写

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定制草莓，驯化番茄：基因编辑有前途 |《自然》技术特写

原创 Nature Portfolio Nature Portfolio 2022-06-17 23:40 发表于上海

原文作者：Michael Eisenstein

植物学家正在利用基因编辑技术，精准提升重要作物的生产力，并增强其对消费者的吸引力。

有什么能比得上夏日里一颗极甜美的草莓呢？可惜，市面上很多草莓都中看不中吃。不过，中国科学院遗传与发育生物学研究所植物学家分子生物学家高彩霞及其团队开创了一种方法，只需要几处简单的基因微调，就可以调控草莓的甜度[1]。高彩霞介绍道：“我们可以把每克草莓的含糖量增至20~41毫克，还可以种出多种甜度的草莓，任君选择。”

包括高彩霞团队在内，越来越多的研究团队正在采用碱基编辑（base editing）和先导编辑（prime editing）技术，力图提高商品粮和商品果蔬作物的产量、抗病虫害能力和对消费者的吸引力。这两种编辑法都是基于广为使用的CRISPR–Cas9系统改良的，利用该系统，可让作物DNA的特定部分发生特定变化。由此，科学家可以进行诸多操作，如微调某种蛋白质的氨基酸序列，以及对决定某一基因表现度的序列进行更改。

高彩霞与团队成员来到团队在北京的种植基地，在温室检查经过了CRISPR基因编辑的西红柿植株。来源：Stefen Chow

生物医学研究者已在争相利用这些技术，研究（也许还可修复）各种与遗传疾病相关的突变。种出更甜的草莓或许乍一看没什么了不起；但正是这一技术，正被用于培育抗病性更强、营养更丰富、单株产量更高的作物。

最重要的是，这些基因编辑系统的前景令人神往：有朝一日，它们或许能成为转基因生物（GMO）培育技术之外的又一选择——目前，人为添加外来基因的转基因生物仍然备受公众质疑，并经受密切监管和审查。中国科学院上海植物逆境生物学研究中心主任朱健康说：“转基因生物携带了其它物种的外来基因，但基因编辑作物不必引入任何外来基因，只要微调其既有基因即可。”未来几年内，市场将会迎来第一批基因编辑水果、蔬菜和粮食；但要规律产出作物，成功顺应和满足全球对农产品的大量需求，朱健康和其他植物学家同行还有很多工作要做。

不漏一个碱基

在CRISPR编辑中，科学家将一种名为Cas9的酶导向基因组的固定位点，随后Cas9会在此附着并修剪DNA的双链。这个靶向过程由一个引导RNA完成，它会在DNA中找出一个匹配序列。

Cas9切割DNA后，细胞会通过非同源末端连接机制修复损伤之处。该修复过程往往会在切割端随机插入或删除碱基对，进而打乱目标基因的功能。美国马里兰大学帕克分校的植物学家戚益平说：“这个方法很高效，但不够精准。用它敲除基因容易，但未必能得到很多符合预期的效果。”如果目标不仅仅是阻止一个基因的自然发展，还要优化其功能，那么，不可预测性会是个大问题。

2016年，美国哈佛大学化学生物学家刘如谦（David Liu）的团队找到了一个解决办法[2]。他们将改造过的Cas9注入胞苷脱氨酶，改变了一个胞苷碱基的化学构成，将一个C–G碱基对转化成了T–A碱基对，该过程称为胞苷碱基编辑。

2017年，刘如谦团队又开发了一种腺嘌呤碱基编辑器，用于将A–T碱基对转化为C–G碱基对[3]，之后又有数十种胞嘧啶碱基编辑器和腺嘌呤碱基编辑器问世。该编辑技术的应用场景从哺乳动物细胞迁移到植物细胞后，效果奇佳，只需略作改动，即能最大限度地提升各种基因编辑技术的效率和精准度。虽然成功率因目标基因和植物物种不同差异很大，但最高达到了100%。

2019年，法国科学家采用了一种胞嘧啶碱基编辑器，在基因eIF4E1中创造了一个单核苷酸变化，该基因编码的一种蛋白质，能够协助RNA转化为各种蛋白质[4]。法国国家农业食品与环境研究院（INRAE）凡尔赛研究中心的植物遗传学家Fabien Nogué参与了此项研究，他介绍道：“有些病毒也会用这种蛋白质完成自身的复制循环。”只要做一处编辑，就足以让拟南芥（ Arabidopsis thaliana ）对苜蓿黄脉病毒这种常见植物病原体基本免疫。

同年，高彩霞团队利用碱基编辑，在小麦基因组的两个位点引入点突变，使小麦具备了抵御多种除草剂的能力[5]。

研究者甚至还可以开展“定向进化”实验，将随机发生的突变植入各种基因，进而发现提升植株某种特定性状的新变体。例如，2020年，高彩霞和同事运用了结合胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑的编辑系统，制造了一个水稻基因的变体，使水稻具备了对乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂的抗药性[6]。高彩霞说：“编辑的目标范围有400个氨基酸，所以我们设计了200个引导RNA，完全涵盖了这个范围。然后我们喷洒除草剂，筛查这些基因突变的植株，看哪些能存活下来。”由此即可筛选出既能抵御除草剂，又不影响植株自身健康的突变了。

“先导”机遇

碱基编辑虽然神通广大，但用武之地并不多。在12种可能的碱基对变化中，只有4种能准确地实现。虽然科学家开发出了数种将胞嘧啶转为鸟嘌呤的碱基编辑器，但是，据团队2021年的估算，这些编辑器总的来说不怎么够用[7]。戚益平说它们“缺乏效率”，认为“在改善效果方面，尚存有待跨越的知识鸿沟”。

此外，碱基编辑也不适用于在单个基因里进行较大的改造，例如增删较长的基因片段。要进行此类改造，可以利用传统的CRISPR–Cas9，进行同源定向修复。由此，在Cas9进行切割的一端，细胞会吸纳一条载有预期序列变化的植入DNA。但是，这一方法用于植物时，效率仍然不高。德国卡尔斯鲁厄理工学院的植物生化学家Holger Puchta说：“在最理想的情况下，效率也就5%。”

北京一处种植基地的温室栽培了经过CRISPR改造的小麦。来源：Stefen Chow

2019年，刘如谦团队提出了另一种基于CRISPR的替代策略，称为先导编辑[8]。与碱基编辑类似，先导编辑采用改造过的Cas9蛋白质进行单链切割，但是Cas9不再与核苷酸修饰酶结合，而是与一种逆转录酶结合。此外，先导编辑还采用了专门设计的引导RNA（即pegRNA），不仅能将编辑机制靶向定位至基因组中的准确位点，还包含了一个模板序列和一个引物结合序列，其中模板序例编码了预期的基因组序列变化。DNA被切割后，引物与DNA在切口处结合，以此为落脚点，逆转录过程将RNA模板转化为DNA，将编码后的序列写入基因组。这一过程不仅能改变任意核苷酸，还能增删长达数十个碱基长度的基因序列。

由此带来的广泛应用，为更复杂、更强大的基因编辑工作打开了大门。Nogué指出，单碱基编辑能避开的植物病原体侵害也就这样了，“改造越简单，病毒就越容易逃过去”。Nogué的团队与INRAE阿维尼翁研究中心的科学家合作，针对严重破坏植株的马铃薯Y病毒（potyviruses），详细检查了自然产生的抗病毒要素，并在eIF4E1基因中发现了一套共5种氨基酸变体，这5种变体能共同保护豌豆植株免于马铃薯Y病毒感染[4]。目前，Nogué正在使用先导编辑，将这一保护转移给马铃薯：“我们认为，通过改变多个氨基酸，可以让植株具备持久的抗病性。”

最初的先导编辑器效率是比较低的，通常和同源定向修复相差无几。但是有些基因组序列似乎比其它更可控，而且设计精密的先导编辑实验，效率可以翻倍[9]。“我觉得先导编辑还有改进空间。”高彩霞说。她的团队已提出多种策略改进先导编辑的效果，如设计复杂的pegRNA，以及采用基于Cas9的编辑复合物的、强化功能的变体。

Nogué团队则在有明确特征的模型植物物种中成功运用了先导编辑。他表示，团队做的某些改良工作，“使得先导编辑像碱基编辑一样高效。如果我们在模型植株中观察到的结果在作物上也成立，那么我认为，先导编辑会非常非常有效。”

种豆得豆

对于研究充分的作物，采用碱基编辑和先导编辑都比较简单。朱健康团队已经就两种技术在水稻的应用开展了广泛的研究。不仅如此，研究还证实，小麦、玉米、西红柿、马铃薯等主要作物均可实现可控的编辑。戚益平指出，多种网络工具，包括高彩霞团队开发的PlantPegDesigner等，都能够帮助研究者选择合适的编辑系统[10]。

但这一过程的若干重要环节仍然相当困难。首先是转化（transformation），即将编辑机制引入植物细胞的过程。最常用的转化策略之一，是采用土壤微生物农杆菌（Agrobacterium tumefaciens） 感染植株，随后将编码了Cas9蛋白质和相关RNA的DNA质粒引入植物细胞。但是，这样引入的DNA还会进入植物的基因组，这是人们不想要的结果，因为这个领域的科学家都在尽量避免永久引入外来DNA。不仅如此，基因组编辑机制的长期表达也有风险，可能会出现不想要的修改。

为在转化过程中杜绝外来DNA，研究者可以把编辑所需材料植入原生质体，即用酶法去除了外部细胞壁的人工培养植物细胞。无论用DNA还是RNA试剂编码这一编辑过程，此类细胞都大大方便了研究者操作临时性的转化。戚益平说：“这样制造的细胞只有细胞膜，就和人类细胞一样。”他指出这也是迅速测试和优化碱基或先导编辑实验的有效方法。另一种方法是使用“基因枪”，把载有蛋白质和RNA的极小弹子射入胚芽期的植物细胞。采用这两种方法，基因编辑机制只会在细胞内短暂活跃，随后即会降解，而不会像把DNA编入原有基因组的做法一样，让基因长期表达出来。

不管采用何种转化方法，研究者随后都要用编辑后的细胞培育出完整的植株。但对于很多植物物种，生物学家偏偏缺少相应的理论知识和专业技能，把合适的细胞分离出来、培育起来，并实现临时性的转化。朱健康说：“自然界有37万余种高等植物，但我们能够成功完成转化的物种只有数十种。”一些新兴技术方案或许会有帮助：例如，过度表达编码了生长调控因素的基因，可以显著增加再生基因编辑植物的效率[11]。Puchta说：“这样一来，很多本来很难转化的物种，就有了转化和编辑的可能。”

此外，作物有许多关乎其生长情况、抗病虫害能力和产出质量的关键性状，人们对其本质生物机制还缺乏基本了解，这也阻碍了相关研究。Nogué说：“不了解基因组，不深刻掌握某一具体性状背后的机制，此类工具就毫无用处。”

不过，基因组分析技术成本越来越低，效率日益提升，会有助于解决该问题；而且，科学家正在尝试将一些常规使用的临床遗传学技术用到农业领域。例如，位于北卡莱罗纳州达勒姆的生物技术公司Pairwise（由刘如谦共同创立并许可使用他的基因编辑技术），正与美国和加拿大的政府部门和学术界合作，识别至少300种独立浆果物种和品种的50余种性状的遗传基础，首席技术官Ryan Rapp说。“我们几乎是从零开始，但现在已合作完成了600余条基因测序。”

超越转基因生物

不过，就算只靠现有的工具，基因编辑也在日新月异地取得进展。Rapp透露，Pairwise的首款基因编辑产品——一种强化风味的绿叶蔬菜，预计2023年进入美国市场。它使用的是标准CRISPR技术，还有其他一些碱基编辑作物正在研发中，包括一款无核樱桃，不过樱桃还在测试中，进入市场的时间会晚一些，因为樱桃树的栽培周期比田里栽种的作物长。

上述产品——当然，还有高彩霞团队的强化甜度草莓——都正是建立公众和监管机构的信任所需的东西。美国农业部、中国农业部等一些监管机构，在作物没有采用外来基因的前提下，对于经过CRISPR编辑的作物，管理尺度比转基因生物宽松。另一些监管机构的规定则更严格。但是，只有令公众信服，基因编辑技术才能有立足之地。戚益平说：“我认为，业界已经达成了共识：要让人们接受基因编辑作物或食品，最好让它们吸引人一些。”

基因编辑技术的成功，可以开启一些真正具有变革意义的应用方式，例如让全球农业未雨绸缪，对抗全球变化的影响。Putcha表示，通过移植单个基因培育耐旱、耐盐作物，进展还很有限。但他认为，另一个方向可能前景大好：通过修改基因，增强野生植物的可食性和农艺性状，驯化粗犷的野生作物。

高彩霞的研究已经表明这个思路行得通。2018年，高彩霞团队及合作方利用了传统的CRISPR–Cas9编辑技术，通过改写控制果实大小、产量和营养物质的5个基因，驯化了一种野生的南美西红柿[12]。“这一驯化过程自然完成需要足足8000年，而我们仅用了一年半。”她说。

参考文献：

1. Xing, S. et al. Genome Biol.21, 230 (2020).

2. Komor, A. et al. Nature 533, 420–424 (2016).

3. Gaudelli, N. et al. Nature 551, 464–471 (2017).

4. Bastet, A. et al. Plant Biotechnol. J. 17, 1736–1750 (2019).

5. Zhang, R. et al. Nature Plants 5, 480–485 (2019).

6. Li, C. et al. Nature Biotechnol. 38, 875–882 (2020).

7. Sretenovic, S. et al. Front. Genome Ed. 3, 756766 (2021).

8. Anzalone, A. V. et al. Nature576, 149–157 (2019).

9. Zong, Y. et al. Nature Biotechnol.https://doi.org/10.1038/s41587-022-01254-w (2022).

10. Lin, Q. et al. Nature Biotechnol.39, 923–927 (2021).

11. Kong, J. et al. Front. Plant Sci.https://doi.org/10.3389/fpls.2020.572319 (2020).

12. Li, T. et al. Nature Biotechnol. 36, 1160–1163 (2018).

原文以Base edit your way to better crops为标题发表在2022年4月27日《自然》的技术特写版块上